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如何选择合适的液相色谱柱

发布于 2015/08/17阅读(2751)来源 上海本昂

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    C-18和C-8硅烷色谱柱是高效液相色谱(HPLC)中最常使用的色谱柱,而且,在美国市场上有多于100种C-18和C-8色谱柱出售。面对这么多可供选择的色谱柱,分析工作者很难从中选出适当的色谱柱来具体使用,同时更难选择出一根合适的替换柱。
对于非极性样品(如小分子芳烃)或弱极性样品(如对羟基苯甲酸酯),C-18和C-8色谱柱是最容易选择的。对于这类样品,色谱柱之间的主要差异在于保留因子(k);而在选择性方面却只有微小的差异。但对于极性和中等极性样品色谱柱的选择却相当困难。例如含氨基或酸性基团的药物化合物。分析工作者会发现极性样品在保留时间、选择性和峰形都有很大的差别。
  色谱柱的选择性和峰形受到担体硅胶的影响远大于键合相的影响。另外,有研究报道在反相色谱中表面硅烷醇、硅酸及金属杂质的影响。在特殊情况下,选择性的差异可由填料制备时使用的键合过程决定的。
通常情况下,色谱工作者选择HPLC色谱柱是通过比较由色谱柱供应商所提供的填料介质的规格来决定的。这些规格内容包括:表面积、末端封尾、含碳量、颗粒形状、颗粒尺寸、孔径、孔容积、装填密度和键合度。含碳量和键合度仅由色谱制造商提供,没有这些规格使用者不可能计算出碳的克数,也不可能计算出一根色谱柱中键合相的微分子数。分析工作者可使用这两个数据来估计一根色谱柱的疏水性质。然而,即使制造商提供所有上述规格数据,使用者也不可能精确地预测出色谱柱对含有极性官能团的化合物的选择性。
  由于色谱的保留时间是基于分析物和填充基质之间许多微妙的相互作用,我们建议使用混合物测试来比较填充基质的规格与性能。Engelhardt 和他的同伴回顾了硅烷反相色谱的特性,并且提出用溶解物试验来描述固定相的疏水性和亲硅基醇特性。另外有一些人也改进了测试条件和方法来解释那些色谱数据,但他们只测试了很少的商品色谱柱,并且在他们的测试混合物中没有羧酸。在本文中,我们使用了一个含有羧酸的测试混合物来收集了86根C-18和C-8硅烷色谱柱(见表1)的数据。我们将测试结果详细描述如下。表1:研究中所使用的色谱柱的生产商(略)。
  在我们的比较中,我们使用了含有6种物质的测试混合物,此6种物质列于图1。每一种物质在测试混合物中都起特殊的作用。尿嘧啶是用于产生空体积。甲苯是测试色谱柱的疏水性。吡啶和N,N-二甲基苯胺是用来测试硅醇基对碱性物质的活性的碱性胺类物质。苯酚是一种弱酸,用于与吡啶联合起来确定活性担体硅的数量。4-正丁基苯甲酸是一种用于测试硅醇基对酸性物质的活性羧酸,此方面是色谱柱制造者开发碱性去活色谱柱来作胺类物质分析时经常忽略的。
  我们使用的流动相是含有65%的乙腈和35%的浓度为0.05M的磷酸钾混合溶液,pH值为3.2。pH=3.2的缓冲溶液可使4-正丁基苯甲酸质子化,同时可提高吡啶和N,N-二甲基苯胺的保留时间的重现性。我们发现使用没有加缓冲溶液的流动相,如65%乙腈和35%水,即使我们使用同一瓶流动相,也无法得到重现性较好的保留时间和峰形。高离子强度的缓冲溶液,如本次测试所使用的0.05M的缓冲溶液,会抑制一些硅醇基的活性(2,5),但对于将胺从一些非碱性去活的反相色谱柱中洗脱下来,有一些抑制作用是必要的。
我们测试过另外两种缓冲溶液,但它们的作用均少于pH=3.2的0.05M磷酸钾溶液。0.01M磷酸钾缓冲溶液在pH=3.2时,胺类化合物在有些色谱柱中产生前移峰。0.05M磷酸钾缓冲溶液在pH=7时,胺类物质产生的峰形比在pH=3.2时更好。吡啶和N,N-二甲基苯胺的pKa均大约为5.2;因此,这些组分在pH=7时未质子化并且呈中性,同时并不与强酸性的硅醇基发生离子交换作用。

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